原創(chuàng)：STEMCELL

阿爾茨海默?。?span>Alzheimer's disease，AD）是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。Alzheimer's association（AAIC）的數(shù)據(jù)顯示：

lAD是美國(guó)排名第六的致死原因。

lAD患者的看護(hù)需要大量的精力，也給家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

l2000-2017年間，死于心臟疾病的患者下降了9%，而死于AD的患者增加了145%。

l每3個(gè)老年人中就有1個(gè)死于AD或者另外一種癡呆（dementia）。

l2019年，AD和dementia在美國(guó)預(yù)計(jì)的花費(fèi)為2900億美金，這個(gè)數(shù)字預(yù)計(jì)會(huì)在2050年到達(dá)11000億美金。

l2019年，美國(guó)AD患者的人數(shù)在580萬(wàn)，這個(gè)數(shù)字預(yù)計(jì)在2050年到達(dá)接近1400萬(wàn)。

*數(shù)據(jù)來(lái)源：2019 Alzheimer's Disease Facts and Figures Report

引起AD的原因目前尚未明確，疾病發(fā)展目前認(rèn)為與大腦中的Beta-Amyloid和Tau蛋白有關(guān)，近期也有研究認(rèn)為大腦中的免疫細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞可能介導(dǎo)了Tau蛋白聚集。目前AD的研究工具包括原代神經(jīng)元，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，3D腦類(lèi)器官等。

3D腦類(lèi)器官

靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的大腦是高度復(fù)雜和有組織性的結(jié)果，2D的原代神經(jīng)元模型包括hPSC衍生的神經(jīng)元模型重現(xiàn)腦組織復(fù)雜結(jié)構(gòu)的能力較為有限，而嚙齒類(lèi)動(dòng)物（包括小大鼠）與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的大腦相比結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單（不含有OSVZ區(qū)域）。hPSC衍生的腦類(lèi)器官則是一種三維（3D）體外培養(yǎng)系統(tǒng)，能夠重現(xiàn)人腦發(fā)育過(guò)程和發(fā)育中的人腦結(jié)構(gòu)。它們提供了一種模擬人體生理環(huán)境的體外模型，專(zhuān)用于研究人神經(jīng)系統(tǒng)特有的神經(jīng)發(fā)育和疾病過(guò)程。

而從FAD和一些SAD病人的iPS衍生的神經(jīng)元具有Tau蛋白的磷酸化水平升高和Beta-Amyloid聚集，從AD病人來(lái)源的3D腦類(lèi)器官也同時(shí)具有Beta-Amyloid的聚集和類(lèi)似neurofibrillary tangles的Tau磷酸化水平升高。因此，近期也有很多科學(xué)家使用3D腦類(lèi)器官進(jìn)行AD的相關(guān)研究。

STEMdiff?腦類(lèi)器官試劑盒為無(wú)血清培養(yǎng)系統(tǒng)，用于從人ES和iPS生成腦類(lèi)器官。它是基于由Madeline Lancaster和Jürgen Knoblich教授所發(fā)布的配方¹。

圖1.使用STEMdiff?腦組織類(lèi)器官試劑盒生成的腦組織類(lèi)器官

（A）使用STEMdiff? 腦組織類(lèi)器官試劑盒在第40天生成的整個(gè)腦組織類(lèi)器官的相位對(duì)比圖。箭頭所指處為皮層類(lèi)似區(qū)域。（B）免疫組化分析結(jié)果顯示這些皮層類(lèi)似區(qū)域具有頂祖標(biāo)志物PAX6（紅色）和神經(jīng)標(biāo)志物β-tubulin III（綠色）。（C-F）（B）圖框內(nèi)區(qū)域的放大圖像。（C）PAX6 (紅色) / β-tubulin III (綠色)。（D） CTIP2 (紅色) / β-tubulin III (綠色)。（E）和（F）Ki-67（綠色）和核染料DAPI（藍(lán)色）共同標(biāo)記的增殖中的組細(xì)胞。（F）室下區(qū)類(lèi)似區(qū)域可見(jiàn)一個(gè)額外的Ki-67+細(xì)胞群。比例尺=（A）1 mm，（B）500 μm 和（C-F）200 μm。在培養(yǎng)腦類(lèi)器官時(shí)，與那些未經(jīng)質(zhì)控的自配試劑相比，該試劑盒顯著提升了類(lèi)器官（包括從難分化的細(xì)胞系）形成的效率（圖2）。

（A）圖2.與使用未經(jīng)質(zhì)控的試劑所生成的腦類(lèi)器官相比，使用STEMdiff?腦類(lèi)器官試劑盒生成的腦類(lèi)器官在質(zhì)量、產(chǎn)量和標(biāo)志物表達(dá)上的表現(xiàn)都更為優(yōu)異。

（A）使用STEMdiff?腦類(lèi)器官試劑盒生成的腦類(lèi)器官，在第40天發(fā)展出厚組織樣結(jié)構(gòu)，且直徑超過(guò) 1 mm。（B）使用未經(jīng)質(zhì)控的試劑生成的類(lèi)器官在第40天并未發(fā)育出厚組織，而是形成了較大的含液胞囊。（C）RT-qPCR分析顯示，在使用STEMdiff?腦類(lèi)器官試劑盒所生成的腦類(lèi)器官中，神經(jīng)祖細(xì)胞與成熟神經(jīng)元出現(xiàn)上調(diào)；（D）對(duì)比之下，采用未經(jīng)質(zhì)控的試劑生成的類(lèi)器官顯示出較差的神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)（平均數(shù) ±SEM，每個(gè)細(xì)胞系的n = 2；每個(gè)分析涉及6個(gè)類(lèi)器官）。數(shù)據(jù)以18S/TBP為標(biāo)準(zhǔn)，并與未分化的hPSC對(duì)照組相比較。（A）和（B）的比例尺 = 1 mm

已使用腦類(lèi)器官進(jìn)行造模的疾病有：

l小頭畸形²

lZIKA病毒誘導(dǎo)的小頭畸形^3-6

l可卡因的作用⁷

l自閉癥譜系障礙/提摩西綜合癥⁸

l阿爾茨海默病⁹

l小膠質(zhì)瘤¹⁰

^lMiller-Dieker綜合癥^11-12

如何從人多能干細(xì)胞生成腦類(lèi)器官？

如何從人多能干細(xì)胞生成腦類(lèi)器官的詳細(xì)操作步驟，包括類(lèi)胚體的形成、神經(jīng)誘導(dǎo)、神經(jīng)上皮擴(kuò)張和類(lèi)器官的成熟（圖3）。

圖3.腦類(lèi)器官生成示意圖

將在mTeSR1?中維持培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）使用溫和細(xì)胞解離試劑（GCDR）解離為單細(xì)胞懸液，以密度為9000細(xì)胞/孔接種至U-Bottom 96孔超低粘附培養(yǎng)板（Corning®）中，接種培養(yǎng)基為EB形成培養(yǎng)基 + 10 μM Rho-kinase抑制劑（ROCKi）。每隔2天更換為不含ROCKi的EB形成培養(yǎng)基。5天之后，將EBs轉(zhuǎn)移到含有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的24孔超低粘附培養(yǎng)板（Corning®）中。對(duì)EB培養(yǎng)2天后，使用液體Matrigel®（減少生長(zhǎng)因子，Corning®）包被EBs。接下來(lái)將它們轉(zhuǎn)移到經(jīng)過(guò)無(wú)組織培養(yǎng)處理的6孔板（12-16類(lèi)器官/孔）中。嵌入的類(lèi)器官在擴(kuò)張培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)3天。在第10天時(shí)，將類(lèi)器官轉(zhuǎn)換到成熟培養(yǎng)基中，然后放置在RPM為57-95的定軌搖床（Infors HT）上對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。在成熟培養(yǎng)基中，每3-4天進(jìn)行換液。在第40天時(shí)，類(lèi)器官進(jìn)行RT-qPCR分析或冰凍切片后進(jìn)行免疫染色。EBs形成、誘導(dǎo)和類(lèi)器官擴(kuò)張的比例尺 = 300 μm。類(lèi)器官成熟的比例尺 = 1 mm。

原代神經(jīng)元培養(yǎng)
標(biāo)準(zhǔn)化的神經(jīng)元培養(yǎng)添加物（如Brewer's B27）包含了多種復(fù)雜的成分13-15。這些原料及相關(guān)制造過(guò)程的質(zhì)量差異性都將導(dǎo)致該添加物的品質(zhì)的變化，已有報(bào)道表明該情況會(huì)對(duì)神經(jīng)元培養(yǎng)造成負(fù)面影響15，16。

NeuroCult? SM1（STEMCELL優(yōu)化后的）是根據(jù)已發(fā)表B27配方1開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的，且經(jīng)過(guò)優(yōu)化，對(duì)于支持成熟神經(jīng)元的培養(yǎng)具有更出色的一致性（圖4）。NeuroCult? SM1神經(jīng)元培養(yǎng)基添加物的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)均為培養(yǎng)出可重復(fù)的、高品質(zhì)的培養(yǎng)物做了充足的準(zhǔn)備。在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，我們首先對(duì)已發(fā)表的添加物進(jìn)行了多因素實(shí)驗(yàn)13,14，確定NeuroCult? SM1的配方和原料的精確規(guī)格。精選的原料由可靠的供應(yīng)商提供，并選用適當(dāng)?shù)闹亟M或合成原材料作為組分的替代物。隨后，建立最佳的制造工藝來(lái)生產(chǎn)這些多組分添加物。

圖4.使用SM1培養(yǎng)體系培養(yǎng)的大鼠原代神經(jīng)元具有突觸前和突觸后標(biāo)志物的表達(dá)

在SM1培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的E18大鼠原代皮層神經(jīng)元。在培養(yǎng)第21天，神經(jīng)元表型成熟，具有廣泛的樹(shù)突棘表達(dá)和樹(shù)突前標(biāo)志物synapsin（A，C；綠色）和樹(shù)突后標(biāo)志物PSD-95（A，B；紅色）的表達(dá)和分布。Synapsin集中在神經(jīng)元胞體和軸突上分散的小突分布，軸突由MAP2（A，D；藍(lán)色）標(biāo)記。

與競(jìng)品（添加有B27的Neurobasal^®）相比，SM1培養(yǎng)系統(tǒng)中具有更多β-微管蛋白III陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元，細(xì)胞活力顯著提升（圖5），并且SM1批次間的穩(wěn)定性要更好。另外，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元在添加有SM1的培養(yǎng)基中具有更多的神經(jīng)突生長(zhǎng)/分支，以及正常的電生理特征（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未顯示）。

圖5. SM1培養(yǎng)體系可大大提高細(xì)胞存活率

（A）在SM1培養(yǎng)體系或競(jìng)品體系（添加有B27的Neurobasal^®）中培養(yǎng)21天的E18大鼠原代皮層神經(jīng)元。在SM1體系中培養(yǎng)的神經(jīng)元數(shù)量顯著性高于競(jìng)品體系（n=4；mean± 95% CI；*p < 0.05)。（B）在添加有SM1或B27類(lèi)似競(jìng)品（競(jìng)品1，2，3）的Neurobasal^®中培養(yǎng)21天的E18大鼠原代皮層神經(jīng)元。使用SM1培養(yǎng)的神經(jīng)元數(shù)量與競(jìng)品相當(dāng)，但批次間的穩(wěn)定性較高。

想做神經(jīng)元的電生理實(shí)驗(yàn)？您需要BrainPhys?神經(jīng)元培養(yǎng)基。

Do your neurons fire together?

圖6.在BrainPhys?完全培養(yǎng)基（BP）、Neurobasal®完全培養(yǎng)基（NB）、突觸抑制劑（BP+抑制劑）和咖啡因（BP+咖啡因）條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元的平均連接率。

n=3（每個(gè)條件下進(jìn)行了3次獨(dú)立的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）；one-way ANOVA，F(3,8) = 854，P<0.0001，使用Tukey's multiple comparisons檢驗(yàn)：ns=不顯著，????P < 0.0001。圖片引用自Saber WA et al. (2018) All-Optical Assay to Study Biological Neural Networks. Front. Neurosci. 12:451. doi: 10.3389/fnins.2018.00451的圖4D。遵循CC BY 4.0. Copyright © 2018 Afshar Saber, Gasparoli, Dirks, Gunn-Moore and Antkowiak。

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